补阳还五汤百草枯肺纤维化TGF-β1/Smad3通路机制研究

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专硕3班-石群锋-2018ZD026 国家自然科学基金 申 请 书 （2 0 1 8版） 资助类别： 面上项目 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 补阳还五汤对百草枯诱导肺纤维化中转化生长因子 β1/Smad 3 通 路的调控机制研究 申 请 人： 石群锋 电 话： 18408257676 依托单位： 成都中医药大学 通讯地址： 成都市十二桥路 37 号 邮政编码： 610075 单位电话： 61800000 电子邮箱： 457470903 @ qq.com 申报日期： 2019 年 03 月 01 日 国家自然科学基金委员会 专硕3班-石群锋-2018ZD026 基本信息 申 请 人 信 息 姓 名 石群锋 性别 男 出生 年月 19780902 民族 汉 学 位 硕士 职称 教授 每年工作时间（月） 8 电 话 18408257676 电子邮箱 457470903@qq.com 传 真 123-3124234 国别或地区 中国 个人通讯地址 成都市十二桥路37号 工作单位 成都中医药大学 主要研究领域 中医药防治呼吸与老年病的研究 依托 单位 信息 名 称 成都中医药大学 联 系 人 XXXX 电子邮箱 XXXXXXXX 电 话 XXXXXX 网站地址 http:// www.cdutcm.edu.cn 合作 研究 单位 信息 单 位 名 称 项目 基本 信息 项目名称 补阳还五汤对百草枯诱导肺纤维化中转化生长因子β1/Smad3 通 路的调控机制研究 英文名称 资助类别 面上项目 亚类说明 附注说明 申请代码 H0110：肺间质性疾病 H0111：急性肺损伤 基地类别 研究期限 2019年01月–2021年12月 研究方向：应用基础研究 申请经费 40.0000万元 中 文 关 键 词 百草枯，肺纤维化，转化生长因子β1/Smad3通路 英 文 关 键 词 Paraquat, pulmonary fibrosis, transforming growth factor beta 1/Smad3 pathway 专硕3班-石群锋-2018ZD026 专硕3班-石群锋-2018ZD026 中 文 摘 要 百草枯（Paraquat，PQ）化学名为1，1'-二甲基4，4'-二联吡啶，分子式：CH3（C5H4N） 2CH3Cl2，分子量：257.2，自1962 年开始作为除草剂被广泛使用。PQ 对人畜的急性毒性 作用很强，且无有效解毒剂，中毒事件经常发生，病死率居高不下。PQ 中毒后肺纤维化 过程中，TGF-β1/Smad3 的表达水平和功能状态会发生改变，亦存在明显的 EndoMT 现 象，但这些细胞和转导因子与 EndoMT 的相关性及它们在PQ 导致肺纤维化过程中的 具体生物学机制均尚未明了。PQ 致肺纤维化是基于直接毒性作用还是由免疫炎症反应 诱导所形成[1]。祝春青的研究表明已有成熟的注射PQ 肺纤维化模型方案，一次性腹腔 注射百草枯可制备小鼠肺纤维化模型,40 和50 mg/kg 为较合适的造模剂量[2]。补阳换 物汤作为活血化瘀的代表方剂，多项研究表明可延缓肺纤维化的进程，并改善肺功能 [3]。本研究拟采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 法检测TGF-β1m ＲNA，Smad3 m Ｒ NA 的表达。同时采用病理切片行HE 染色和Masson 染色，光镜下观察病理组织学变化 并摄片，参照Szapiel［4］等方法评价各组大鼠肺组织肺泡炎程度及肺纤维化程度。并设 想在以下几方面深入研究：1、扩大样本量，确证其抗炎作用；2、延长观察时间，重点观 察后期的抗纤维化作用；3、观察其对成纤维细胞的作用及其机制。国内外目前未见同类 报道。 参考文献: [1] 陆远强,姜久昆.转化生长因子β1/Smad3 通路和百草枯中毒所致上皮-间充质 转变[J]. 中华危重症医学杂志(电子版),2017,10(3):145-148. [2]祝春青,陈冬波,王喆,等.腹腔注射百草枯构建小鼠肺纤维化模型[J].生物技术 通讯,2012,23(4):563-566. [3]杨晗,王飞,王全林,等.补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1/Smad3 表达 的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(24):240-244. [4] Szapiel S V，Elson Na，Fulmer J D，et al．Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse［J］．Am Rev Respir Dis，1979，120: 893. Paraquat (PQ) is chemically known as 1,1'-dimethyl 4,4'-bipyridine, the molecular formula: CH3 (C5H4N) 2CH3Cl2, molecular weight: 257.2, since 1962 as a herbicide has been widely used. The acute toxicity of PQ to human and animal is very strong, and there is no effective antidote, poisoning events often occur, the mortality rate is high. In the process of pulmonary fibrosis after PQ intoxication, the expression level and functional status of TGF-beta 1/Smad3 will change, and there is also obvious EndoMT phenomenon. However, the 专硕3班-石群锋-2018ZD026 correlation between these cells and transduction factors and EndoMT, and their specific biological mechanism in the process of pulmonary fibrosis induced by PQ are still unclear. PQ induced pulmonary fibrosis is based on direct toxicity or [1] induced by immune inflammatory response. Zhu Chunqing's research shows that there is a mature model of pulmonary fibrosis by injection of PQ. Paraquat can be injected intraperitoneally once to establish pulmonary fibrosis model in mice. As a representative prescription of promoting blood circulation and removing blood stasis, Buyang Changwu Decoction can delay the process of pulmonary fibrosis and improve pulmonary function. In this study, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expression of TGF-beta 1 mRNA and Smad3 mRNA. At the same time, HE staining and Mason staining were used for pathological sections, histopathological changes were observed and photographed under light microscope, and the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis in lung tissues of rats in each group were evaluated by Szapiel [4]. And envisaged in the following areas: 1, expand the sample size to confirm its anti-inflammatory effect; 2, prolong the observation time, focusing on the late anti-fibrosis effect; 3, observe its effect on fibroblasts and its mechanism. No similar reports have been reported at home and abroad. Reference: [1] Lu Yuanqiang, Jiang Jiukun. Transforming growth factor beta 1/Smads pathway and epithelial-mesenchymal transition induced by paraquat poisoning [J].Chinese Journal of Critical Care Medicine (electronic edition), 2017, 10 (3): 145-148. [2] Zhu Chunqing, Chen Dongbo, Wang Zhe, et al. Pulmonary fibrosis model of mice was established by intraperitoneal injection of paraquat [J].Biotechnology Communication, 2012, 23 (4): 563-566. [3] Yang Pi, Wang Fei, Wang Quanlin, et al. Effect of Buyang Huanwu Decoction on the expression of TGF-beta_1/Smad3 in lung tissue of pulmonary fibrosis rats [J].Chinese Journal of Experimental Prescription, 2013, 19 (24): 240-244. [4] Szapiel S V, Elson Na, Fulmer J D, et al. Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse [J]. AmRev Respir Dis, 1979, 120:893. 专硕3班-石群锋-2018ZD026 项目组主要参与者（注: 项目组主要参与者不包括项目申请人） 编号 姓名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 证件号码 每年工作时 间（月） 1 XX 教授 博士 成都中医药大学 000000000000 1231231231423@ 126.com 5 2 XX 博士生 硕士 成都中医药大学 000000000000 1231231231423@ 126.com 6 3 XX 主治医师 博士 成都中医药大学 000000000000 1231231231423@ 126.com 5 4 XX 主治医师 硕士 成都中医药大学 000000000000 1231231231423@ 126.com 6 5 XX 硕士生 学士 成都中医药大学 000000000000 1231231231423@ 126.com 8 6 XX 硕士生 学士 成都中医药大学 000000000000 1231231231423@ 126.com 8 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 7 3 2 3 1 3 专硕3班-石群锋-2018ZD026 国家自然科学基金项目资金预算表(单位： 万元) 序号 科目名称 金额 备注 1 一、直接费用 40.0000 2 1、 设备费 3 (1)设备购置费 4 (2)设备试制费 5 (3)设备改造与租赁费 6 2、 材料费 23.4000 SD大鼠，转染，RT- PCR，病理，芯片等 7 3、 测试化验加工费 2.1000 8 4、 燃料动力费 9 5、 差旅/会议、国际合作与交流费 5.7000 学术会议，差旅费 10 6、 出版/文献/信息传播/知识产权事务费 3.0000 文献检索，论文发表， 邮费，通讯费等 11 7、 劳务费 3.8000 12 8、 专家咨询费 13 9、 其他支出 2.0000 14 二、 自筹资金来源 专硕3班-石群锋-2018ZD026 预算说明书(定额补助) （请按《国家自然科学基金项目资金预算表编制说明》中的要求，对各项支出的主要用途和测算理由及合作 研究外拨资金、单价≥10 万元的设备费等内容进行详细说明，可根据需要另加附页。） 申请经费预算： 总共拟申请经费 40 万元人民币。 支出预算具体说明如下： 1、直接用于本项目研究的的费用共计25.4 万元人民币，占总申请费用的68.3%， 其中科研业务费12 万元人民币，占总申请经费的33.3%。7 万元用于病理标本检 测、电镜观察、免疫组化、流式细胞仪等检测费用等。其余7 万元分别用于能源、 动力、资料费、信息费、学术交流差旅费等。实验材料费10 万元人民币，主要用于 购买体内、外实验所需试剂、试剂盒、实验动物、实验药品和其他常用试剂等。实 验室改装费1.4 万元，主要用于实验室维修、通风条件的改善等。 2、国际合作与交流费用：计划支出5.7 万元，占总申请经费的20%。主要用于邀请 国外学者来沪进行课题研究交流的部分旅差费、讲课费以及项目组成员出国进 行学术交流的旅差费等。 3、劳务费：计划支出3.8 万元人民币，占总申请经费的6.66%。主要用于参与本项 目的研究生、技术人员等的劳务费、加班费等。 4、管理费：计划支出 2 万元，占总申请经费的 5%。按基金委财务管理规定提取. 专硕3班-石群锋-2018ZD026 专硕3班-石群锋-2018ZD026 报告正文 参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。请 勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。 （一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）： 1．项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析， 需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会 发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参 考文献目录）； 百草枯( Paraquat，PQ)，商品名为克芜踪、对草快，化学名称是1，1'-二甲基-4，4'-联吡啶 二氯化物，为联吡啶阳离子盐，易溶于水。因其除草效果好被广泛应用于农业 生产中，但随 之出现的自服、误服而导致的中毒事件的发生率也呈逐年上升趋势[1]。临床上发现，大剂量 中毒患者多因多器官功能衰竭而急性死亡; 中小剂量中毒患者在度过急性肺损伤期，部分患 者却在后期因不可逆性肺纤维化所导致的呼吸衰竭而死亡，为后期主要死因。目前无有效治 疗方法，百草枯通过多种机制诱导肺纤维化，如氧化损伤、肺泡上皮损伤和Ⅱ型肺泡细胞凋 亡和细胞因子网络等，其中细胞因子网络中，目前认为转化生长 因子 β ( transforming growth factor-β，TGF-β) 是致纤维化关键性的细胞因子，其介导的 Smad 通路是纤维化发生 的可能机制之一［2］，Smad3 家族中的 Smad3 是TGF-β /Smad3 信号通路活化蛋白，其正常 表达与肺纤维化的形成直接相关。TGF-β 被公认为纤维化形成与发展中最为关键的细胞因 子之一，是纤维化形成的启动枢纽［3］，也是目前所知最强的致纤维化因子。 近年来，中医药防治肺纤维化的研究取得了一定成就。研究发现，益气活血法能够改善 肺纤维化患者的临床症状和体征，并能延长生存时间。补阳还五汤出自清代名医王清任的 《医林改错》，是益气活血法的代表方剂。现代药理研究表明[4]，该方的各主要单味中药均对 实验性肺间质纤维化具有良好的防治作用，改善微循环，抑制过敏介质的释放，可延缓或阻 断肺间质纤维化进程。补阳还五汤在防治肺纤维化方面有着良好的应用前景，但具体作用机 制不明。杨晗[5]等的研究表明补阳还五汤可以通过调控 TGF-β1/Smad3 信号通路中的TGF- β1，Smad3 过度表达，达到对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的治疗作用。但补阳还五汤对百草 枯所致纤维化是否有效，以及用药时机方面仍未有相关研究。 主药参考文献： [1]罗雅娟, 何旭. 百草枯中毒致肺纤维化的机制研究及治疗现况[J]. 毒理学杂志, 2013(3). [2] Bonniaud P，Margetts P J，Kolb M，et al． Transient transgene expression